Pomôžte rozvoju stránky a zdieľajte článok s priateľmi!

PCR je test, ktorý sa používa pri diagnostike mnohých chorôb. Metóda PCR umožňuje preukázať priamu prítomnosť baktérií v organizme, konkrétne jeho DNA. PCR sa používa okrem iného v v diagnostike lymskej boreliózy. Čo je to technika PCR? Čo je to PCR v reálnom čase?

Obsah:

  1. PCR (test) – čo je to technika PCR?
  2. PCR (test) - aplikácia metódy PCR
  3. PCR (test) - Lymská choroba
  4. PCR (test) - výsledky. Môžu byť falošne pozitívne?
  5. PCR (test) - výsledky. Môžu byť falošne negatívne

PCR(polymerázová reťazová reakcia) je primárna metóda používaná v genetických a molekulárnych laboratóriách. V roku 1983 ho vyvinula Kara Mullis, ktorá zaň získala Nobelovu cenu v roku 1993.

PCR (test) – čo je to technika PCR?

PCR testspočíva vo viacnásobnej amplifikácii (zvyčajne v 30-40 cykloch) špecifického fragmentu DNA, napríklad génov kódujúcich boréliové proteíny, s použitím enzýmu polymerázy.

Potom sa na vizualizáciu amplifikovaného fragmentu DNA používajú špeciálne molekulárne farbivá. PCR je vďaka amplifikácii špecifických fragmentov DNA ultracitlivou metódou.

Pri metóde PCR sa fragmenty DNA amplifikujú pomocou špecifických párov primérov pre danú oblasť bakteriálnej DNA. Napríklad cieľové oblasti PCR používané pri diagnostike lymskej choroby sú gény kódujúce proteíny, napr. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Biologický materiál, z ktorého je možné test vykonať, je:

  • krv
  • rez kože z migrujúceho erytému
  • cerebrospinálny mok
  • synoviálna alebo chrupavková tekutina
  • moč

PCR (test) - aplikácia metódy PCR

Okrem diagnostiky lymskej boreliózy dokáže metóda PCR odhaliť špecifické fragmenty DNA iných mikroorganizmov alebo ľudí. Preto sa metóda PCR používa aj v:

  • diagnostika a monitorovanie vírusových infekcií: herpes vírusy (herpes vírus, herpes zoster, Epstein-Barr, cytomegalovírus), HIV, vírusy hepatitídy (HBV a HCV)
  • diagnostika a monitorovanie bakteriálnych infekcií, najmä tých baktérií,ktoré nemožno identifikovať prostredníctvom kultúr, napr. tuberkulóza
  • diagnostika a monitorovanie neoplastických ochorení: leukémia, rakovina prsníka, kolorektálny karcinóm, rakovina pľúc
  • diagnóza predispozície k rakovine: rakovina prsníka a vaječníkov (gény BRCA1 a BRCA2), kolorektálny karcinóm (gény APC a CHEK2)
  • diagnóza genetických ochorení: hemochromatóza (gén HFE), talasémia (gény HBA1 a HBA2), celiakia (gény HLA)
  • testy otcovstva, ktoré zisťujú DNA kompatibilitu dieťaťa a otca
Stojí za to vedieť

V súčasnosti existuje mnoho modifikácií metódy PCR. Napríklad pri diagnostike lymskej boreliózy sa využívajú najmä metódy nested PCR (nested PCR) a real-time PCR ( ). Posledná uvedená metóda je kvantitatívna a umožňuje určiť presný počet kópií DNA borélií v testovanom biologickom materiáli

PCR (test) a lymská borelióza

Základom diagnózy lymskej boreliózy je sérologické vyšetrenie. Existujú však klinické situácie, ktoré môžu spôsobiť, že tieto testy budú falošne negatívne:

  • sérologické okno, t.j. počiatočné obdobie infekcie, v ktorom telo ešte nevytvára špecifické IgM a IgG protilátky proti boréliám
  • u imunokompromitovaných ľudí, ktorí nevytvárajú dostatok protilátok
  • prítomnosť imunitných komplexov, ktoré pozostávajú z boréliových antigénov a špecifických protilátok proti nim a zabraňujú detekcii protilátok sérologickými metódami

Ak je u pacienta podozrenie na príznaky lymskej boreliózy a výsledky sérologického testu sú negatívne, môže sa vykonať molekulárny test založený na metóde PCR.

DNA spirochét Borrelia sa dá zistiť už v skorých štádiách infekcie, pretože počet spirochét v telesných tekutinách je vtedy najvyšší.

Pri diagnostike lymskej boreliózy sa primárne používajú sérologické metódy ako ELISA, ale v niektorých klinických situáciách je nápomocné genetické vyšetrenie pomocou metódy PCR

Čím dlhší čas od infekcie uplynie, tým nižšia je pravdepodobnosť detekcie bakteriálnej DNA. Preto sa v niektorých prípadoch pred vykonaním testu PCR baktérie pestujú na špeciálnom médiu 1-2 týždne a potom sa test vykoná.

Tento prístup sa používa v prípade podozrenia na lymskú lymskú boreliózu a odber mozgovomiechového moku. V neskorej fáze infekcie je vhodnejšie vykonať test ELISA

Metóda PCR by sa nemala používať pri rutinnej diagnostike lymskej boreliózy z dôvodu nedostatočnej štandardizácieo výskyte odrôd Borrelia burgdorferi v Poľsku

V prípade ťažkostí s diagnostikou (najmä v počiatočnom štádiu ochorenia) je však výsledok testu PCR nápomocný v diagnostickom procese.

Pozitívny výsledok testu znamená, že v testovanom materiáli bola zistená prítomnosť DNA Borrelia burgdorferi a jej variantov, ale nevysvetľuje, či je organizmus aktívne infikovaný. Na druhej strane negatívny výsledok nevylučuje prítomnosť baktérií v tele.

Niektoré laboratóriá ponúkajú testovanie na prítomnosť DNA borélií v kliešťoch. Výsledok takéhoto testu však nie je základom pre diagnózu lymskej boreliózy u uhryznutého človeka

PCR - výsledky. Môžu byť falošne pozitívne?

PCR je ultracitlivá metóda a zároveň veľmi citlivá na kontamináciu. Preto je pri testovaní založenom na PCR veľmi dôležité vybrať vhodnú internú kontrolu na vylúčenie falošne pozitívnych výsledkov.

Kľúčový význam má aj správny odber materiálu na testy, ako aj skúsenosti a spoľahlivosť diagnostika, ktorý test vykonáva.

PCR - výsledky. Môžu byť falošne negatívne

Ako pri každom laboratórnom teste, aj pri metóde PCR sa môžu objaviť falošne negatívne výsledky. Tu je kľúčové odobrať krv na vhodný antikoagulant, pretože niektoré z nich, ako napríklad heparín, môžu inhibovať PCR reakciu.

Odber materiálu po začatí antibiotickej terapie môže znížiť účinnosť PCR reakcie a zvýšiť pravdepodobnosť falošne negatívnych výsledkov.

Netreba zabúdať ani na to, že baktérie Borrelia žijú v krvi a telesných tekutinách veľmi krátko, pretože vďaka špeciálnym receptorom veľmi rýchlo prenikajú do „ťažko dostupných“ miest v tele.

Na rozdiel od diagnostiky iných mikroorganizmov je preto počet spirochét borélií v biologickom materiáli malý, niekedy až na hranici detekcie metódy PCR. To môže tiež spôsobiť falošnú negativitu.

Referencie

  1. Dunaj J. et al Význam metódy PCR v diagnostike lymskej boreliózy. Prehľadávať Epidemiol. 2013, 67, 119 – 123.
  2. Laboratórna diagnostika chorôb prenášaných kliešťami Odporúčania pracovnej skupiny: Národná komora laboratórnych diagnostikov, Štátny ústav verejného zdravotníctva-Národný ústav hygieny, Národný konzultant v oblasti infekčných chorôb, Oddelenie infektológie a neuroinfekcií , Lekárska univerzita v Białystoku, Poľská virologická spoločnosť, Varšava 2014.
  3. Ružić-Sabljić E. a Cerar T. Pokrok v molekulárnej diagnostike lymskej boreliózy. Expert Rev Mol Diagn. 2022Jan; 17 (1): 19-30.
  4. Valones M.A.A. a kol.Princípy a aplikácie polymerázovej reťazovej reakcie v medicínskych diagnostických odboroch: prehľad. Braz J Microbiol. 2009 Jan-Mar; 40 (1): 1-11.
O autoroviKarolina Karabin, MD, PhD, molekulárna biologička, laboratórna diagnostika, Cambridge Diagnostics PolskaPovolaním biológ so špecializáciou na mikrobiológiu a laboratórny diagnostik s viac ako 10-ročnou praxou v laboratórnych prácach. Absolvent Vysokej školy molekulárnej medicíny a člen Poľskej spoločnosti humánnej genetiky Vedúci výskumných grantov v Laboratóriu molekulárnej diagnostiky na Katedre hematológie, onkológie a vnútorných chorôb Lekárskej univerzity vo Varšave. Titul doktora lekárskych vied v odbore lekárska biológia obhájila na 1. lekárskej fakulte Lekárskej univerzity vo Varšave. Autor mnohých vedeckých a populárno-náučných prác z oblasti laboratórnej diagnostiky, molekulárnej biológie a výživy. Denne ako špecialista v oblasti laboratórnej diagnostiky vedie obsahové oddelenie v Cambridge Diagnostics Polska a spolupracuje s tímom nutričných špecialistov na CD Dietary Clinic. Svoje praktické poznatky z diagnostiky a diétnej terapie chorôb zdieľa s odborníkmi na konferenciách, školeniach, v časopisoch a na webových stránkach. Zaujíma ju najmä vplyv moderného životného štýlu na molekulárne procesy v tele.

Pomôžte rozvoju stránky a zdieľajte článok s priateľmi!

Kategórie:

Výskum